Aðferðir til að bera kennsl á próteinfosfórun og glýkósýleringu

Helstu aðferðir til að bera kennsl á fosfórun eru sem hér segir: a. In vitro fosfórunargreining: Geislamælt kínasaviðbrögð með 32P-gamma-ATP er hægt að nota til að greina fosfórunarstöðu in vitro; þessi aðferð er hálfmagnuð, ​​en getur ákvarðað mólmassa fosfórýleraðra próteina. b. Merking á geislavirkum púls: Til að greina fosfórun in vivo er hægt að nota geislavirka púlsmerkingu; frumur eru ræktaðar í nærveru 32P-ortófosfats og síðan er ákveðið prótein ónæmisútfellt með ákveðnu mótefni. Geislasamsætan sem fæst með útfellingu er greind með SDS-PAGE rafdrætti og magngreind með röntgenfilmu. Þessi aðferð getur greint fosfórun við ýmsar lífeðlisfræðilegar aðstæður. c. Fosfórunarsértæk mótefni: Það eru tveir flokkar fosfórunarsértækra mótefna. Fyrsti flokkurinn er alhliða fosfórýlerandi týrósín/serín/þreónín mótefni sem mun bindast hvaða fosfórýleruðu týrósíni, fosfórýleruðu seríni og fosfórýleruðu þreónín sameind, óháð aðliggjandi amínósýruleifum; annar flokkur mótefna er fosfórýleringarsértækt amínósýrueðlismótefni. Auðvitað er hægt að sameina ofangreindar aðferðir við gagnaöflunarham eða eftir massagreiningu til að bera kennsl á (hugsanlega) fosfórunarstaði, nota alhliða mótefni fyrir fosfórunarstaði til að ákvarða hvort markpróteinið sé fosfórað á ákveðinni tegund stað með ónæmisútfellingu (IP) .

Glýkósýleringargreiningu er hægt að framkvæma með ensímmeltingu (eins og trypsínmeltingu) á próteininu sem á að greina, fylgt eftir með greiningu á glýkópeptíðum með vökvaskiljun-massagreiningu (LC-MS) eða vatnssækinni víxlverkunarskiljun-tandem massagreiningu (HILIC-MS/) MS) til að bera kennsl á öll prótein með sérstakar glýkan sameindir, eða glýkan bindisæti í markpróteininu. Að auki, fyrir sum glýkópeptíð, getur massagreiningu (MS) greining á ósnortnum próteinum veitt gögn um auðkenningu próteinategunda og glýkósýleringarstöðu þeirra, en með lægri upplausn.

Í stuttu máli, þó að aðferðirnar til að bera kennsl á próteinfosfórun og glýkósýleringu séu ólíkar, er hægt að greina báðar með því að nota massagreiningu, þar með talið auðkenningu á fosfórýleruðum/glýkósýleruðum próteinum, fosfórýlunar/glýkósýlerunarbreytingarstöðum og breytingastigum. Massagreining er einnig orðin ein vinsælasta rannsóknatækni eftir þýðingarbreytingar vegna yfirburða upplausnar, nákvæmni og næmni.